L'imagerie super-résolue est une technique maintenant bien développée et de nombreuses techniques sont maintenant commercialisées par les grands fournisseurs de microscopie.

Trois familles de techniques sont développées :

• Les méthodes de type STED visant à améliorer la résolution mettant en forme l'illumination pour dépasser la limite de résolution imposée par la diffraction. Cette technologie n'est pas implémentée sur le plateau LITC.
• Les méthodes pointillistes, ou de microscopie de localisation
• Les méthodes d'illumination structurées

PALM/STORM : Les méthodes pointillistes de super-résolution

Le PALM (Photo-activated localization microscopy) et le STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy) sont des méthodes d’imagerie en microscopie champs large. Ces méthodes pointillistes permettent d’imager des structures plus petites que la limite de diffraction (200-300 nm). Elles utilisent les propriétés de clignotement (blinking), de changement de longueur d'onde d'émission (switching) ou de photo-activation de molécules fluorescentes. Il peut s’agir de marquages par anticorps (STORM) ou de protéines de fusion (PALM).

Le principe est d’activer de façon stochastique un petit nombre de fluorophores. Dans ces conditions, la localisation du centre de chaque tache de diffraction permet d'estimer la position d'une molécule fluorescente avec une précision de pointé principalement limité par le rapport signal sur bruit. Après photoblanchiment des molécules imagées, de nouvelles molécules peuvent être localisé par activation. En réalisant un grand nombre d’acquisitions, on peut ainsi reconstruire des structures moléculaires avec une résolution avoisinant 30nm.

Petite vidéo pour illustrer la technique (Image prise avec un capteur de téléphone portable).

Un projet de microscopie PALM/STORM est en développement sur la plateforme. Nous disposons d’un système SPT PALM Nikon. Nous travaillons à adapter cette technique à l’observation de structures dans le noyau eucaryote (levures, cellules mammifères) alors qu’elle est plus classiquement utilisée pour l’observation de structures proches de la lamelle.

Un projet de microscopie corrélative électronique/PALM est également en cours de développement.

Imagerie SIM rapide (développer en partie sur la plateforme LITC)

Une grande majorité des techniques d'imageries super-résolues utilisent les propriétés de la fluorescence pour contourner les lois de la diffraction optique. Ces techniques sont potentiellement photo-toxique (STED) ou lente (PALM/STORM). Une alternative est l'illumination structurée qui autorise l'utilisation de toutes les protéines fluorescence conventionnelle. Le principe consiste à éclairer l'échantillon avec une grille périodique la plus fine possible sous différente phases et orientations (typiquement entre 9 et 15 images en régime classique).  Un procédé de reconstruction d'image basé sur la connaissance de ces grilles autorisent aujourd'hui des résolutions de 90 à 60 nm pour l'imagerie live pour les meilleurs systèmes existants [].3 conditions par l'imagerie SIM inférieure à 100nm doivent être maitrisé : la rapidité des séquences d'illumination, le contraste des grilles produites à la limite dans le cadre d'ouverture numérique de très fortes ouvertures, et la reconstruction des images dans des situations rendus complexes dû à l'imagerie du vivant.

Un projet de deux microscopes en développement, basé sur une technique couplant l'Illumination Structurée SIM et la localisation 3D, est en développement en 2016 au sein du site LITC LBCMCP.

• gauche : Chaine laser HOME MADE pour l'imagerie SIM 2D/3D et SIM non linéaire 2D.
• droite a : Principe de l'imagerie structurée avec 9 grilles à fort contrastes à la limite de résolution optique pour l'imagerie SIM 2D
• droite b : extension de la résolution grâce aux méthodes de déconvolution assitées par des grilles
• droite bas : Exemple d'imagerie superrésolue à 80nm de résolution d'adhésion focale (image conventionnelle à gauche et SIM à droite). Échelle 640nm

Différentes techniques seront accessibles pour s'adapter aux mieux aux contraintes de l'imagerie du vivant. L'intérêt est d'associer ces techniques sur des machines déjà éxistantes et spécialisées dans le domaine l'optomanipulation (pince optique et optogénétique). Ces techniques sont :

• SIM conventionnel TIRF 2D et SIM 3D 4 (90nm à 75nm de résolution) couleurs (excitation à 405,445nm,488nm, 561nm) à une fréquence temporelle unique 20 images superresolue par secondes. Cette technique autorisera ainsi l'imagerie superrésolue  de phénomène rapide telle que la mitose et l'endocytose (accessible en janvier 2016).
• SIM Nonlinéaire 2D rapide autorisant une résolution de 50nm à l'aide de molécules photoactivable en GFP avec une fréquence d'acquisition unique à 5 images par seconde dédiée à l'imagerie du cytosquellete et de la chromatine. (Accessible aux printemps 2016).
• Imagerie 3D SIM isotrope mutilicouleurs à un seul objectif. L'objectif est de rendre démocratique l'imagerie isotropique ultrarésolue sur un statif de microscope conventionnelle (accessible en fin d'année 2016).
• Imagerie SIM TIRF 2D associée à la localisation 3D par collection supercritique en collaboration avec une jeune PME Parisienne AbbeLight (implémentation en juillet 2016). la résolution 3D autour de 20nm en   Z sera envisageable.
• Reconstruction 3D SIM via une nouvelle méthode de deconvolution SIM adaptée au tissue vivant (appellé BLIND SIM) ce qui n'est pas envisageable actuellement sur des algorithmes commerciaux.

Equipes Toulousaine

• Equipe Suzanne (CBI LBCMCP)
• Equipe Wang (CBI LBCMCP)
• Equipe Legube (CBI LBCMP)
• Equipe Maridonneau-Parini (IPBS).

Partenaire Académique en Imagerie :

• Equipe SEMOX de l'intitut Fresnel : Nicolas Sandeau, Hugues Giovannini, Anne Sentenac
• Equipe microscopie Jena IPHT (Institute of Photonic Technology) : Rainer Heintzmann, Aurélie Jost, Ronny Foeaster.

Industriels

• Oxxuis
• Abbe Light Instruments

• INSERM PLAN CANCER
• Région Midi Pyrénnée (projet PRSIM)
• IBISA

[1] Li, D., Shao, L., Chen, B. C., Zhang, X., Zhang, M., Moses, B., ... & Kirchhausen, T. (2015). Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science, 349(6251), aab3500.

[2] Ayuk, R., Giovannini, H., Jost, A., Mudry, E., Girard, J., Mangeat, T., ... & Sentenac, A. (2013). Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm. Optics letters, 38(22), 4723-4726.

[3] Mudry, E., Belkebir, K., Girard, J., Savatier, J., Le Moal, E., Nicoletti, C., ... & Sentenac, A. (2012). Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nature Photonics, 6(5), 312-315.