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L'imagerie super-résolue est une technique maintenant bien développée et de nombreuses techniques sont maintenant commercialisées par les grands fournisseurs de microscopie.
Trois familles de techniques sont développées :
PALM/STORM : Les méthodes pointillistes de super-résolution
Le PALM (Photo-activated localization microscopy) et le STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy) sont des méthodes d’imagerie en microscopie champs large. Ces méthodes pointillistes permettent d’imager des structures plus petites que la limite de diffraction (200-300 nm). Elles utilisent les propriétés de clignotement (blinking), de changement de longueur d'onde d'émission (switching) ou de photo-activation de molécules fluorescentes. Il peut s’agir de marquages par anticorps (STORM) ou de protéines de fusion (PALM).
Le principe est d’activer de façon stochastique un petit nombre de fluorophores. Dans ces conditions, la localisation du centre de chaque tache de diffraction permet d'estimer la position d'une molécule fluorescente avec une précision de pointé principalement limité par le rapport signal sur bruit. Après photoblanchiment des molécules imagées, de nouvelles molécules peuvent être localisé par activation. En réalisant un grand nombre d’acquisitions, on peut ainsi reconstruire des structures moléculaires avec une résolution avoisinant 30nm.
Petite vidéo pour illustrer la technique (Image prise avec un capteur de téléphone portable).
Un projet de microscopie PALM/STORM est en développement sur la plateforme. Nous disposons d’un système SPT PALM Nikon. Nous travaillons à adapter cette technique à l’observation de structures dans le noyau eucaryote (levures, cellules mammifères) alors qu’elle est plus classiquement utilisée pour l’observation de structures proches de la lamelle.
Un projet de microscopie corrélative électronique/PALM est également en cours de développement.
Imagerie SIM rapide (développer en partie sur la plateforme LITC)
Une grande majorité des techniques d'imageries super-résolues utilisent les propriétés de la fluorescence pour contourner les lois de la diffraction optique. Ces techniques sont potentiellement photo-toxique (STED) ou lente (PALM/STORM). Une alternative est l'illumination structurée qui autorise l'utilisation de toutes les protéines fluorescence conventionnelle. Le principe consiste à éclairer l'échantillon avec une grille périodique la plus fine possible sous différente phases et orientations (typiquement entre 9 et 15 images en régime classique). Un procédé de reconstruction d'image basé sur la connaissance de ces grilles autorisent aujourd'hui des résolutions de 90 à 60 nm pour l'imagerie live pour les meilleurs systèmes existants [].3 conditions par l'imagerie SIM inférieure à 100nm doivent être maitrisé : la rapidité des séquences d'illumination, le contraste des grilles produites à la limite dans le cadre d'ouverture numérique de très fortes ouvertures, et la reconstruction des images dans des situations rendus complexes dû à l'imagerie du vivant.
Un projet de deux microscopes en développement, basé sur une technique couplant l'Illumination Structurée SIM et la localisation 3D, est en développement en 2016 au sein du site LITC LBCMCP.
Différentes techniques seront accessibles pour s'adapter aux mieux aux contraintes de l'imagerie du vivant. L'intérêt est d'associer ces techniques sur des machines déjà éxistantes et spécialisées dans le domaine l'optomanipulation (pince optique et optogénétique). Ces techniques sont :
La mesure des forces intracellulaires est un enjeu crucial pour la biologie moderne. Une méthode de choix est la méthode de piège optique. Le projet consiste à développer une nouvelle voie expérimentale combinant pinces optiques et imagerie de fluorescence pour l’étude des forces exercées sur différentes organelles directement piégées dans le cytoplasme. La difficulté consiste à découpler la propriété rhéologique de la cellule, la production de force interne liée à l’activité de l'ATP (acto-myosine, dynéine, kinésine) et la dynamique de l’adhérence entre les organelles. L'originalité de notre système consiste à mesurer simultanément ces forces intracellulaires et les propriétés viscoélastiques du cytoplasme par pince optique. Deux méthodes émergentes ont été récemment publiées et permettent de mesurer directement des forces sur cellule vivante : Fluctuation Dissipation Optical Tweezers (FDTOT [1]) et Force Spectrum Microscopy (FSM)[2]. Ces méthodes utilisent des propriétés de l’équilibre thermodynamique en haute fréquence pour déduire la réponse linéaire du milieu (méthode FSM) ou bien estimer le piège optique (méthode FDT) dans un milieu inconnu par l’application du théorème de fluctuation-dissipation. En combinant les mesures des mesures passive et active, nous pouvons accéder aux forces s’appliquant sur la sonde (méthode FDT) ou bien aux propriétés rhéologique de la cellule (FSM) [1][2]. Cependant ces mesures seront très largement influencées par la physique d’adhérence de la sonde (ou de l'organelle piégée telle que des vésicules lipidiques). La combinaison de l'optique rapide (déflection rapide du laser), d'une méthode de suivi 3D référencée par interférométrie, et de l'imagerie de fluorescence nous donnera une information supplémentaire sur la dynamique d'adhérence des organelles piégées (voir animation). Dans ce cas, une mesure complète des forces exercés sur l'organelle devrai être possible sans connaissance à priori.
Cette méthode s'adapte à différents modèles biologiques : de la cellule unique jusqu'au tissue (levure, cellule humaine, épithélium de culture MDCK, tissue de drosophile). Ces mesures directes renforceront les stratégies de modélisation du vivant dans le cadre de la morphogénèse (activité scientifique de l'équipe Suzanne). Elles renforceront aussi la compréhension de la transmission de l'information génétique au cours de la mitose ('Equipe Tournier du LBCMCP). Enfin, elle ouvre des nouvelles perspectives concernant le transport des vésicules lipidiques, de l'activité cytoplasmique intracellulaire dans des contextes telle que l'apoptotose, la sénescence ou la mitose [1]. La figure 2 résume les différentes stratégies développées pour les différents modèles cellulaires.
